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制備scFv接頭DNA

更新時(shí)間:2012-09-02點(diǎn)擊次數(shù):1397

器材和試劑]

●  PCR試劑和設(shè)備
●  1ug任何舍有scFv及(GIy4Ser)3接頭的載體
●  RHuJH引物、RHuVκ引物和RHuVλ引物,10pmol/ul
 
[方法]
1.在0.5ml微量離心管內(nèi)配制用于擴(kuò)增的主混合液。所顯示的主混合液用于VH—Vκ接頭。對(duì)于VH—Vλ接頭的主混合液,n=29。
                        單個(gè)反應(yīng)主混合液/ul         (n=25)
●  水                     37                         925
●  10×Vent緩沖液        5.0                        125
●  20×dNTPs             2.5                        62.5
●  Vent DNA聚合酶        0.5                        12.5
2.取24支0.5ml試管,每管分別加入RHuJH引物和RHuVκ引物,各2ul。RHuJH引物和RHuVκ引物共有24種可能的結(jié)合形式。而對(duì)于VH—Vλ接頭,則用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可,共可編為28管。如無(wú)加熱蓋,可以加入l滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。
3.設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照管,加入50ul主混合液。
4.每個(gè)樣本取1.0ul scFv基因模板(約1ng),加入到主混合液中。
5.取46u1主混合液分別加入到步驟2已制備的24個(gè)管內(nèi)。
6.預(yù)加熱PCR反應(yīng)格到94℃。
7.以94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃1分鐘的條件共循環(huán)25次,擴(kuò)增接頭序列。
8.將PCR產(chǎn)物用2.0%TBE瓊脂糖膠電泳純化,切取PCR產(chǎn)物;用Geneclean抽提,并重懸DNA于50ul水中。

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