技術(shù)文章
Technical articles
很多免疫學(xué)技術(shù)依賴于標(biāo)記抗體的使用。對抗體進(jìn)行標(biāo)記主要是用于抗原的定位分析，在某些情況下，也可以對混雜有大量其他分子的樣本中的抗原進(jìn)行定量檢測。由于抗體與其相應(yīng)抗原具有很高的親和力，因此帶有易識別標(biāo)記物的抗體可以定位分析抗原，并且是一種理想的快速價廉的定量測定方法。需要使用標(biāo)記抗體的三種方法，即免疫染色法、免疫印跡法和免疫分析。此三種方法均能定位復(fù)雜混合物中的抗原，而且通過適當(dāng)?shù)膶φ找材芏繙y定。就免疫染色法而言，其目的就是定位正常細(xì)胞環(huán)境中出現(xiàn)的抗原。在此背景下，所有抗原均...
1．如果使用經(jīng)免疫沉淀法得到的蛋白，按常規(guī)洗滌免疫復(fù)合物。盡可能*去除zui后的洗液。如果使用其他來源的蛋白，則將其轉(zhuǎn)入20mmol／L的磷酸鹽溶液中(pH7．0)，或直接在20／1l水中重懸蛋白。蛋白濃度應(yīng)低于lmg／m1。2．加入20u1．5％SDS和20mmol／LDTI。3．加熱至85C10min，仔細(xì)將上清液移入另一試管。4．加入10rd新鮮配制的0．2mmol／LN-乙基順了烯二酰亞胺(NEM)，12．5mg／m1的水溶液為飽和溶液)，使用前臨時配制。85℃溫育1...
所有的固定方案必須做到：①防止抗原丟失；②透化細(xì)胞以便使抗體進(jìn)入；③盡量使抗原保持能與抗體結(jié)合的狀態(tài)；④維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)。常用的固定劑種類很多，固定劑的正確選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性。固定劑可分為兩大類：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如乙醇和丙酮能夠去除脂類物質(zhì)使細(xì)胞脫水，把蛋白質(zhì)沉淀在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上。交聯(lián)劑一般通過自由氨基基團(tuán)把生物分子橋連起來，形成一個相互連接的抗原網(wǎng)。兩種方法均使蛋白質(zhì)抗原部分變性。因此，在細(xì)胞染色中，能夠識別變性蛋白的抗體更加有用。在某些情況下...
1．主要內(nèi)容純化率為1000～10000倍?？焖偌兓乖?，層析柱?？芍貜?fù)使用。可獲得純化的抗原。不能用于定量測定。純化效果取決于抗原的濃度和抗體的親和力需要適當(dāng)純化的抗體。2．操作步驟(1)將抗體結(jié)合到蛋白A或蛋白G微珠上。對于一般用途的層析柱，每毫升濕的微珠大約可以結(jié)合2mg單克隆抗體或親和純化的多克隆抗體。將抗體和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的勻漿，在總量為10ml的溶液中加入大約lml微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動混勻。(2)用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉(pH9...
標(biāo)記蛋白具有許多優(yōu)點(diǎn)。原則上，該方法為檢測各種細(xì)胞成分中感興趣的蛋白提供廠新的手段。①如果開放閱讀框已經(jīng)被克隆化，但是由于蛋白是新發(fā)現(xiàn)的，或者由于蛋白免疫原性較弱，目前尚沒有針對該蛋白產(chǎn)物的抗體時，此標(biāo)記技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。隨著基因組的研究，由基因工程進(jìn)入蛋白工程，標(biāo)記技術(shù)顯得越來越重要。②由于標(biāo)記物不是天然蛋白氨基酸序列的固有部分，與標(biāo)記物結(jié)合的試劑在進(jìn)行蛋白提純過程中，對蛋白功能產(chǎn)生影響的可能性較小。③只要具備適當(dāng)?shù)妮d體，標(biāo)記蛋白可在任何細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；例如，相同的標(biāo)...
所謂Real-TimePCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。real-timePCR技術(shù)即實(shí)時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因...
摘要：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院近日成功育成10頭攜帶綠色熒光蛋白和瘦素蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆豬引起各界廣泛關(guān)注，2月3日記者在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)了解到，這一成果將有助于脂肪沉積以及人類肥胖病和糖尿病等疾病的研究，也將使轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)在功能基因驗(yàn)證、疾病模型、異種器官移植等領(lǐng)域的應(yīng)用前景更為廣闊。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院近日成功育成10頭攜帶綠色熒光蛋白和瘦素蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆豬引起各界廣泛關(guān)注，2月3日記者在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)了解到，這一成果將有助于脂肪沉積以及人類肥胖病和糖尿病等疾病的...
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