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[方法]1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。2．在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細(xì)菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細(xì)胞和DNA均放于冰上。3．將80ng已純化且無(wú)鹽的DNA與50g1細(xì)菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電?。?dòng)脈沖，立即加入1．0ml...
抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中制備噬菌體。在開始實(shí)驗(yàn)之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計(jì)算每毫升抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中細(xì)菌的數(shù)目。在600nm（A600）處的某個(gè)特定吸光值下，抗體文庫(kù)中細(xì)菌數(shù)目較未感染細(xì)菌數(shù)目低一些。這或許是因?yàn)楹匈|(zhì)粒的文庫(kù)細(xì)菌體積更大，或者是存在死細(xì)菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系，吸光值即可用于細(xì)菌數(shù)目的計(jì)算。對(duì)于噬菌體的制備（文庫(kù)救援），來(lái)自文庫(kù)儲(chǔ)存料的起始接種量應(yīng)比文庫(kù)容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后，細(xì)菌濃度的A600不應(yīng)超過(guò)0．05。采用文庫(kù)容...
1．在每毫升zui后的噬菌體懸液（例如來(lái)自實(shí)驗(yàn)方案13．11）中，加入0．45g氯化銫，充分混勻至溶解。2．用吊桶式轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)男吞?hào)）離心溶液，15℃17h，噬菌體將濃縮在組分1和組分2中（。組分1的濃度較高，但組分2的體積較大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取這些組分。如果是*次使用本實(shí)驗(yàn)方案，那么先收集所有條帶并分別對(duì)其檢測(cè)將是明智之舉。3．將收獲的溶液對(duì)PBS透析過(guò)夜。4．通過(guò)感染大腸桿菌DH5cF，或TGl滴定各個(gè)不同組分中噬菌體，并保存滴度zui高的組分。通常，噬菌...
從噬菌體抗體文庫(kù)中分離抗原特異性抗體，是通過(guò)讓噬菌體進(jìn)入到在抗原上進(jìn)行的重復(fù)性選擇循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。理想情況下，僅需l輪選擇即可完成。但事實(shí)是，絲狀噬菌體常常非特異性地結(jié)合到支持物表面，從而限制了每輪所能獲得的富集水平。實(shí)際上，需要2～5輪的選擇?，F(xiàn)在已設(shè)計(jì)了許多各自不同的選擇方法；其中包括在固相支持物上包被抗原進(jìn)行生物淘選，使用免疫親和層析注或BIAcore傳感芯片，用生物素化抗原選擇E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳動(dòng)物E403細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞E41-4...
1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過(guò)夜。PBS中10ug／m1的濃度是包被抗原的標(biāo)準(zhǔn)濃度。但有時(shí)需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封閉每個(gè)板孔，37℃孵育2小時(shí)。4．用PBS洗滌板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗體的培養(yǎng)基上清，用移液器反復(fù)吹吸混勻，室溫孵育1小時(shí)。7．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次...
噬菌體展示可使抗體親和力提高到1000倍以上。很典型的起始點(diǎn)是自噬菌體抗體文庫(kù)中分離特異性抗體。為完成親和力的成熟（親和力的增加），要對(duì)抗體序列進(jìn)行多樣化；突變基因文庫(kù)展示在絲狀噬菌體表面上，并在抗原上選擇具有更高親和力的結(jié)合性抗體。盡管整個(gè)過(guò)程已相當(dāng)清晰，但研究者在進(jìn)行體外親和力成熟前必須明確：提高特定抗體親和力將會(huì)產(chǎn)生預(yù)期的生物學(xué)效果。當(dāng)嘗試用抗體中和循環(huán)中的毒素或生長(zhǎng)因子時(shí)，更高的親和力就顯得特別重要。在此情況下，抗體與抗原都分布于同樣的區(qū)域，能使抗原抗體的相互作用達(dá)到...
利用含有目標(biāo)受體的復(fù)雜混合物，對(duì)噬菌體展示肽文庫(kù)進(jìn)行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細(xì)胞或組織表面等。在此情況下，目標(biāo)就是要鑒定出結(jié)合于特定受體分子或結(jié)合于一組具有特定性質(zhì)的受體上的多肽。我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關(guān)的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結(jié)合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來(lái)鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關(guān)抗體的相應(yīng)配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來(lái)自HCV感染者和非感染者的血清（以下...
實(shí)驗(yàn)過(guò)程的zui后步驟是以合成每一個(gè)結(jié)合性或定位性的多肽來(lái)作為熒光標(biāo)記多肽[典型的熒光素或若丹明（rhodamine）]，然后在靜脈注射后測(cè)定其生物分布的。熒光標(biāo)記也使得多肽能在隨后的沒有任何修飾的受體分離中被使用：可以使用熒光多肽在基于細(xì)胞的表達(dá)性克隆系統(tǒng)中分類受體陽(yáng)性的細(xì)胞，并且也可以通過(guò)高親和性的鼠抗熒光素單抗體的使用把熒光多肽直接固定到固體基質(zhì)上。在有偶合劑（couplingreagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情況下，加入異硫氰酸熒光素I（f...
當(dāng)前位置：
